Innovatie in het lab toxicologie: TDM van immunosuppressiva met LC-MSMS

Therapeutische drug monitoring (TDM) van immunosuppressiva is essentieel om de farmacologische respons en het uiteindelijke resultaat van (orgaan)transplantaties te verbeteren. Bloedconcentraties moeten accuraat gemeten worden om een efficiënte en veilige therapie te garanderen, gezien de lage therapeutische index van de gebruikte geneesmiddelen (toxische/therapeutische dosis). Bovendien is er een risico op ernstige nevenwerkingen bij overdosering en transplantaatrejectie bij onderdosering.

De meeste laboratoria maken gebruik van commerciële immunoassays, maar deze zijn beperkt in specificiteit, gevoeligheid en lineair bereik. LC-MSMS (tandem massaspectrometrie) is een geavanceerde analytische techniek die recent in het laboratorium werd geïntroduceerd en wordt beschouwd als dé referentiemethode voor dosering van immunosuppressiva. In het laboratorium voor toxicologie van de dienst Klinische Scheikunde AZ Sint-Jan AV werd daarom een analyse geoptimaliseerd voor de simultaanbepaling van Cyclosporine A (CsA) en Tacrolimus.

Een klassieke massaspectrometer (MS) bestaat uit drie fundamentele onderdelen:

De ionenbron waar de moleculen geïoniseerd en gefragmenteerd worden
De analysator waar de gevormde ionen gescheiden worden op basis van hun verhouding tussen massa (m) en lading (z) (m/z)
De detector waar de gescheiden ionen gedetecteerd worden

Massaspectrometrie is een sleuteltechniek in de (bio-)analyse van geneesmiddelen en toxische stoffen. Door koppeling met gaschromatografie (GC) of met vloeistofchromatografie (LC) kan de massaspectrometer een globaal kwalitatief en kwantitatief beeld geven van de samenstelling van zeer complexe mengsels.

Ionisatie

Het te analyseren monster kan rechtstreeks in de ionenbron geïnjecteerd worden of kan eerst aan een chromatografische scheiding (zoals liquid chromatography (LC)) onderworpen worden. In het laatste geval komen de gescheiden componenten sequentieel de massaspectrometer binnen en worden ze individueel geanalyseerd.

Verschillende ionisatiemethodes zijn beschikbaar, maar voor de meeste biochemische analyses wordt ‘electrospray ionisation’ (ESI) (figuur 1) gebruikt. Bij dit type ionisatie wordt het staal als een spray van kleine druppels in de bron geleid doorheen een geladen capillair. Zowel positieve als negatieve ionen kunnen gevormd worden, de keuze wordt voorafgaandelijk gemaakt en hangt af van de chemische eigenschappen van de te analyseren componenten.

Scheiding van ionen

De belangrijkste functie van het tweede onderdeel, de analysator, is de scheiding van de gevormde ionen. Het massabereik, de accuraatheid en de resolutie van de meting zijn afhankelijk van het type massaspectrometer. Voor klinische toepassingen worden vooral quadrupool massaspectrometers gebruikt. Een quadrupool analysator bestaat uit vier parallelle staven waarop een gelijkspanning, met daarop een gesuperponeerde wisselspanning, aangesloten wordt. Door die spanningen te variëren zullen op elk tijdstip enkel de ionen met een bepaalde m/z-waarde een stabiele oscillerende baan beschrijven doorheen de vier staven en de detector bereiken.

Tandem massaspectrometers

Tandem massaspectrometers (MSMS) hebben twee analysatoren die van elkaar gescheiden zijn door een ‘collision cell’ waar de ionen die door de eerste analysator werden doorgelaten verder fragmenteren (figuur 2). Beide kunnen ingesteld worden om een bepaald massagebied te scannen, of om één of meerdere individuele ionen met een specifieke m/z-waarde te selecteren. Tandem massaspectrometers zijn hierdoor uiterst geschikt om op basis van karakteristieke fragmentatiepatronen specifieke componenten te detecteren in complexe mengsels, zelfs in zeer lage concentraties.

Detectie

De detector neemt de nu gescheiden ionenstroom waar en slaat de signalen samen met hun relatieve intensiteit op onder de vorm van massaspectra. Door interpretatie van de karakteristieke spectra kan de identiteit en de concentratie van de verschillende componenten in het monster bepaald worden.

Toepassing: Simultane bepaling van cyclosporine A (CsA) en Tacrolimus

Na afloop van de transplantatie geldt dat de klinische resultaten in termen van transplantaatrejectie en toxiciteit gerelateerd zijn aan de blootstelling aan immunosuppressiva, meestal uitgedrukt als AUC. Niet alleen CsA maar ook andere immunosuppressiva kennen een grote interpatiënt variabiliteit in dosis/concentratie verhouding. Verschillende targetconcentraties worden gebruikt in functie van het getransplanteerde orgaan, de tijdsduur sinds de transplantatie en de geneesmiddelencombinatie.

Reeds lange tijd wordt gesuggereerd dat de bepaling van C0 (dalspiegel) niet optimaal is als index voor blootstelling aan CsA. Indien een 12 uur dosisinterval voor CsA gebruikt wordt, geeft C0 een beperkte of zelfs slechte correlatie met de AUC0-12 of met AUC0-4, het gedeelte van de AUC waar het meest variatie optreedt. De beste correlatie met AUC0-4 wordt bekomen door de bepaling van een monster afgenomen op 2 uur na inname (C2) dat dus een betere merker is voor de CsA-absorptie, maar dit vereist de kwantificatie van CsA in concentraties tot 2500 µg/L.

Voor TDM van Tacrolimus is de bepaling van C0 het meest relevant gezien de goede correlatie met de AUC. De klinisch predictieve waarde van deze dalspiegel wordt echter sinds kort ook in vraag gesteld. TDM van immunosuppressiva wordt in de meeste klinische laboratoria uitgevoerd met commerciële immunoassays, die een lineair bereik hebben dat slechts aangepast is aan de lagere concentraties bij C0 monitoring. Voor bepaling van C2 concentraties moet een verdunning uitgevoerd worden, wat aanleiding geeft tot afwijkingen in de meetresultaten. Bovendien werd aangetoond dat de specificiteit van immunoassays te wensen overlaat, onder meer door klinisch significante crossreactiviteit voor verschillende, soms inactieve metabolieten. Gezien het gehalte aan interfererende metabolieten varieert in functie van het tijdstip van de bloedafname is het evenmin verantwoord om correctiefactoren te gebruiken.

Deze gegevens zetten ons er toe aan om een snelle en gevoelige LC-MSMS methode te ontwikkelen met een groot dynamisch bereik voor de simultaanbepaling van CsA en Tacrolimus. Tandem massaspectrometrie sluit interferenties uit van de belangrijkste metabolieten en van andere veel gebruikte geneesmiddelen. De methode kan en zal in de toekomst ook verder uitgebreid worden voor dosering van andere immunosuppressiva. Zo hopen we de beste kwaliteit te leveren aan de aanvragende artsen en de patiënten door de risico’s op toxiciteit en afstoting van het getransplanteerde orgaan te minimaliseren.

Naast de toxicologische toepassingen zullen tal van innovatieve methoden ontwikkeld worden met LC-MSMS, onder meer voor de neonatale screening en de analyse van laag geconcentreerde steroïdhormonen, zoals serum testosteron bij de vrouw, in de dienst Laboratorium Klinische Scheikunde.