De triple en eerste trimester-screeningtesten, het uitgebreide echografische onderzoek en de leeftijd van de zwangere vrouw bepalen in sterke mate of er een verhoogd risico is op een numerieke chromosoomafwijking bij het ongeboren kind. Voor een snelle diagnose van de meest frequente foetale chromosoomafwijkingen werd recent een DNA-testmethode ontwikkeld, gebaseerd op de polymerase kettingreactie (PCR, Polymerase Chain Reaction). Met een negatieve en positieve predictieve waarde van meer dan 99,5% levert de test een betrouwbaar resultaat op, dat bekend is na 24 tot 48 uur. Bovendien kunnen we met deze methode ook een bijmenging van maternale cellen opsporen en onderscheiden van de foetale cellen.

Figuur 1: Chromosomenkaart van een patiënt met trisomie-21 (Downsyndroom)

 

Karyotypering

Chromosomale afwijkingen bij het ongeboren kind worden al meer dan dertig jaar opgespoord door karyotypering. Dit gebeurt door foetale cellen uit het vruchtwater of de chorionvilli in kweek te brengen en een stof (Colcemide) toe te voegen aan het kweekmedium. Zo wordt de celdeling geblokkeerd op het moment dat het DNA zich in de kern heeft opgerold tot chromosomen (de metafase). De chromosomen kunnen dan zichtbaar gemaakt worden door het celmateriaal op een microscoopglaasje te brengen en met een kleurstof te behandelen. Door deze kleuring verkrijgen de chromosomen een specifiek bandenpatroon, waardoor we ze kunnen herkennen. Met digitale beeldanalyse kunnen we vervolgens een chromosomenkaart opstellen (figuur 1).

Karyotypering spoort zowel afwijkingen op in de structuur van de chromosomen (structurele afwijkingen) als afwijkingen in het aantal chromosomen (numerieke afwijkingen), en is nog steeds te beschouwen als de gouden standaard. Het is echter een arbeidsintensieve en tijdrovende techniek. De lange kweektijd van foetale cellen en de analyse zorgt dan ook voor psychologische stress bij de toekomstige ouders.

Ongeveer 95% van de chromosoomafwijkingen die worden vastgesteld bij prenataal DNA-onderzoek zijn numerieke afwijkingen van de chromosomen 13, 18, 21, X of Y. Een snelle analyse specifiek voor deze afwijkingen betekent dus een grote stap vooruit. De syndromen die ontstaan als gevolg van deze numerieke afwijkingen zijn het Patausyndroom (trisomie 13), het Edwardssyndroom (trisomie 18), het Downsyndroom (trisomie 21), het Turnersyndroom (monosomie X) en het Klinefeltersyndroom (XXY). De overige 5% van de chromosoomafwijkingen zijn overwegend van structurele aard, zoals chromosomale translocaties waarbij fragmenten van chromosomen onderling verwisseld worden. Deze structurele afwijkingen zijn meestal klinisch irrelevant voor de huidige zwangerschap, maar een genetisch consult van de beide ouders voor eventuele volgende zwangerschappen wordt toch aanbevolen. Numerieke afwijkingen van andere chromosomen dan chromosoom 13, 18, 21, X en Y zijn uiterst zeldzaam en uiten zich nagenoeg altijd als ernstige echografische abnormaliteiten.

Snelle prenatale detectie van numerieke chromosoomafwijkingen door Fluorescentie In situ Hybridisatie (FIsH)

Figuur 2: FIsH-analyse voor de opsporing van trisomie-21. FISH-hybridisatie van vruchtwatercellen met een specifieke chromosoom-21 probe (gemerkt met groen fluorochroom). Een blauwe tegenkleuring zorgt ervoor dat de celkern zichtbaar wordt.

Met de FISH-techniek – een sneller alternatief voor karyotypering – worden geselecteerde chromosoomafwijkingen opgespoord in niet-gekweekte foetale cellen. In het begin van de jaren ’90 brak deze methode door in de prenatale diagnostiek. Met deze techniek worden fluorescent gemerkte DNAstukjes gebonden aan het DNA in de celkern. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop wordt het aantal chromosomen geteld: een normale cel bevat twee kopieën van elk chromosoom, bij trisomieën zijn het er drie. De techniek laat echter niet toe een onderscheid te maken tussen contaminerende cellen afkomstig van de moeder en van een vrouwelijke foetus. De microscopische beoordeling is bovendien arbeidsintensief omdat een groot aantal kernen wordt bekeken. Figuur 2 toont een voorbeeld van een FISH-experiment uitgevoerd op foetale cellen met trisomie 21.

 
 
 
 
 
 
 
 

Snelle prenatale detectie van numerieke chromosoomafwijkingen door DNA-analyse

De FISH-techniek werd in de prenatale diagnostiek recent nagenoeg volledig vervangen door de QF-PCR (Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction). Deze methode zorgt voor een snelle diagnose van numerieke afwijkingen voor de chromosomen 13, 18, 21, X en Y, en wordt uitgevoerd op DNA geïsoleerd uit vruchtwater- of chorionvillibiopten. Door gebruik te maken van PCR worden korte DNA-fragmenten (enkele honderden baseparen) in een proefbuis vermenigvuldigd. Bij QF-PCR amplificeert men DNAfragmenten specifiek voor de chromosomen 13, 18, 21, X en Y. Deze zijn bovendien zo gekozen dat het ‘lengte-polymorfe’ fragmenten zijn; de lengte van de DNA-fragmenten varieert tussen verschillende chromosomen en dus ook tussen verschillende individuen. De lengtebepaling van de DNA-fragmenten gebeurt door capillaire elektroforese.

Bij een normale foetus bekomt men voor ieder chromosoom (met uitzondering van de geslachtschromosomen) twee DNA-fragmenten: één van het maternale chromosoom en één van het paternale chromosoom (figuur 3a). Een trisomie, met als meest prevalente voorbeeld de trisomie-21 die het Downsyndroom veroorzaakt, resulteert in een patroon van drie DNA-fragmenten. De DNAmerkers kunnen hierbij alle drie een verschillende lengte hebben (1:1:1), ofwel is de combinatie beperkt tot 2 DNA-fragmentlengtes en wordt een verhouding tussen beide DNAfragmenten van 2 op 1 vastgesteld (figuur 3b).

Zowel de FISH-techniek als de QF-PCR-methode laten een snelle diagnose (24 à 48 uur) toe van de geanalyseerde chromosomen. Het voordeel van QF-PCR is dat de analyse op een gering aantal cellen kan gebeuren omdat een gevoelige DNA-amplificatie wordt gebruikt (de methode is vergelijkbaar met de gerechtelijke DNA-spooranalyse). Bovendien kan op basis van het bekomen DNA-profiel een mogelijke contaminatie met maternale cellen opgespoord worden, waardoor een foute interpretatie vermeden wordt. Een belangrijk voordeel van QF-PCR ten opzichte van FISH en karyotypering is de mogelijkheid tot automatisering.

QF-PCR wordt uitgevoerd in het Laboratorium Klinische Biologie (afdeling Moleculaire Biologie) van AZ Sint-Jan Brugge-Oostende AV in een samenwerkingsverband met het Centrum voor Medische Genetica van UZ Gent (prof. Anne De Paepe en prof. Frank Speleman). Er is een vast weekschema voor de uitvoering van de techniek uitgewerkt, zodat antwoordtijden tot een minimum worden herleid.
 
 

Figuur 3: Principe van ‘Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction’ (QF-PCR). Bij een gezonde foetus is ieder chromosoom tweemaal aanwezig. Eén chromosoom is afkomstig van de vader, het andere van de moeder. Een foetus met een trisomie bezit drie exemplaren van het betreffende chromosoom, die uiteraard ook afkomstig zijn van de biologische vader en moeder maar door een foutieve celdeling niet correct zijn overgeërfd. We kunnen de chromosomen herkennen door DNA te vermenigvuldigen met PCR waar herhalingen van een korte
genetische code (als blokjes voorgesteld) in een verschillende aantal voorkomen. De DNA-fragmenten zijn hierdoor lengte-polymorf.

Figuur 4: Het resultaat van een QF-PCR bij een foetus met trisomie-21 is
hierboven afgebeeld. De DNA-merkers op chromosoom-21 zijn aangeduid. De aanwezigheid van drie DNA-fragmenten met dezelfde piekhoogte (D21S1435, D21S11 en D21S1437) of twee DNA-fragmenten met een piekhoogte in een verhouding van
2 op 1 (D21S1411) kan worden waargenomen. Merker D21S1409 is niet informatief bij deze analyse.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Referenties

1. Cirigliano et al. Ann N Y Acad Sci. 2006;1075:288-98.
2. Mann et al. Eur J Hum Genet. 2004;12(11):907-15.
 

Ook nog in Artikels